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自由扩散的单分子FRET中的校正

荧光共振能量转移(Förster resonance energy transfer, FRET)是生化实验中的常见手段,一般用于检测生物大分子是否有相互作用、共定位或构象变化。

单分子FRET(single-molecule FRET, smFRET)将单分子超高时空分辨率的优势和FRET对距离变化的敏感性结合起来,是研究蛋白分子构象变化的有力武器。然而由于噪音、荧光染料自身性质和仪器检测效率等原因,我们只能得到表观的测量值,所以需要对其进行校正。

背景噪音

背景噪音在时间分辨率$dt$的情形下,光子数的分布服从Poisson分布,$I_b \sim P(\lambda)$,其中 $\lambda = r \cdot dt$,$r$为背景噪音的光子产生速率。首先需要对采集到的原始信号$I_D$和$I_A$扣除背景,对于背景噪音的拟合有三种办法。

平均值法

将收集得到的单分子荧光trace直接求平均。由于一段荧光时间序列中的大部分都是噪音,所以直接求平均值(或给定一个阈值上限,排除掉由荧光分子产生的有效信号),就可近似地得到平均噪音水平。

对噪音的光子数分布进行拟合

在一段单分子荧光trace中,噪音会一直存在,而荧光分子只有经过聚焦体积时才会发出荧光,所以对于一段合适的荧光trace,大部分信号应该都是噪音,所以其光子数分布应该为一开始一个很高的poisson分布,再叠加上很小一部分的指数分布,该指数分布是由于荧光染料分子进入聚焦体积发光而产生的,对于噪音的poisson分布影响很小。所以我们可以对光子数分布的前面部分(例如前80%)进行Poisson拟合,从而得到平均噪音水平。

对噪音的光子寿命进行拟合

因为 $I_b \sim P(\lambda)$,所以噪音光子的抵达时间的间隔 $\tau_b \sim E(\lambda)$,可以通过时间相关单光子计数卡(time-correlated single photon counting, TCSPC)根据光子的间隔时间来区分背景噪音和有效信号。

因为Poisson分布和Exponential分布密切相关,所以本质上和对光子数分布进行拟合是一样的。

漏光

Donor染料的发射光谱通常会有一部分和Acceptor通道的滤光片透光波段重叠,使得Acceptor通道可以检测到部分来自Donor的光子。这部分信号强度和Donor在Donor通道的信号强度呈正比,通常可以采用Donor-only的样品,检测其在两个通道的信号强度,然后做比得到Donor在Acceptor通道的漏光系数 $\alpha$。

也可以在测量双标样品的single-molecule FRET后,通过零峰的位置进行校正。因为漏光,校正前零峰不在FRET效率=0的位置,然而既然都叫零峰,其理论值=0,所以根据下式:

量子产率与接收效率

在FRET过程中,不考虑漏光和直接激发的情况下,Donor和Acceptor发光强度为:

其中$I_0$为激发光光强,$\sigma_D$为Donor荧光分子的吸收截面,$Q_D$和$Q_A$为对应的量子产率,$\eta_D$和 $\eta_A$为对应通道的接收效率,$E$为理论FRET效率。对上式微分可得:

我们可以设想一个Acceptor先于Donor猝灭的过程,这样Donor通道的信号强度会增加 $\Delta I_D$,Acceptor通道的信号强度会降低 $\Delta I_A$,FRET效率会从$E$降到0,通过TIRF可以将Acceptor猝灭的过程挑出来,并测到 $\Delta I_D$和 $\Delta I_A$,将上两式相除,就可以得到:

这样就得到了TIRF的校正系数 $\gamma_T$。

对于Confocal显微镜,需要用一个双标的标准样品,在TIRF上测出一个理论值,再在Confocal显微镜上测FRET效率,根据理论值来反推出校正系数 $\gamma_c$。

其中$E$为通过TIRF测得的标准样的FRET效率理论值,$E_{app}$ 为标准样品在Confocal上测得的扣除了背景和漏光的表观FRET效率值。在得到了校正系数 $\gamma_c$后,Confocal的校正公式为:

其中$I_D$与$I_A$是校正了背景和漏光后的信号。

直接激发

直接激发项的校正需要用到ALEX (Alternating-Laser Excitation)激光光源,这在国内配备得较少,不过随着发展,应该会逐渐成为Confocal单分子测量的标配。简单讲,对于Acceptor-only的样品,有以下关系:

其中上标的$Dex$和$Aex$代表了采用Donor激发光还是Acceptor激发光,将两式相除就可得到直接激发的校正系数$d$:

于是直接激发项可以表示为:

在ALEX实验中对Acceptor通道信号减掉直接激发项即可。

Jacobi行列式

Jacobian行列式常用于积分换元:

通常可写为 $\frac{\partial (u, v)}{\partial (x, y)}$。Jacobi行列式具有下列重要性质:

  1. $ \left( \frac{\partial u}{\partial x} \right)_y = \frac{\partial (u, y)}{\partial (x, y)} $

  2. $ \frac{\partial (u, v)}{\partial (x, y)} = -\frac{\partial (v, u)}{\partial (x, y)} = \frac{\partial (-v, u)}{\partial (x, y)} $

  3. 设$u, v, r, s$都是独立变量$x, y$的函数,则:$\frac{\partial (u, v)}{\partial (x,y)} = \frac{\partial (u, v)}{\partial(r, s)}\frac{\partial (r, s)}{\partial (x, y)}$

  4. $ \frac{\partial (u, v)}{\partial (x,y)} = 1/\frac{\partial (x,y)}{\partial (u, v)} $

对于一维情况:

在FRET分布的校正中,理论FRET效率的概率密度函数应该服从高斯分布$N(\mu, \sigma)$,而校正前的FRET效率的概率密度函数暂时未知,但是有如下关系:

其中$F(E) = Ae^{\frac{-(E-\mu)^2}{2\sigma^2}}$ 为理论FRET分布的概率密度函数,根据FRET的校正公式:

可得到:

代入上式即可得到表观FRET分布的概率密度函数$f(E_{app})$。

当校正系数$\gamma$取不同值时,理论FRET效率与表观FRET效率呈非线性关系:
gamma

校正前的FRET分布呈现偏态:
apparent FRET distribution